0115 837 0503 info@aureliabio.com

G Protein-Coupled受体

GPCR的(G蛋白偶联受体)是膜蛋白转导细胞外刺激成胞内信号的最大和最多样化的家庭。它们调节多种生理过程,也是充分验证的“成药”的目标。

我们已经使用Promega公司的NanoBRETTM值GPCR试剂检查的荧光标记普萘洛尔到β2MAR示踪剂在3D支架格式的结合动力学。我们研究了使用本示踪剂来测量竞争已知β2MAR化合物的结合和测量在这些化合物置换示踪物的速率。

此格式优于化合物在2D孔板纹的传统方法显著优点:

  • 细胞附着于支架,因此,可板之间有效地移动,替换缓冲器无需水洗并提供该能力使用“测定准备化合物平板”
  • 细胞可以在支架上冷冻保存,然后解冻,从相同的库存或批次中反复使用,从而提高数据的一致性

图生物发光能量转移(BRET),以测量与β2肾上腺素能受体(β2MAR)化合物接合

该技术可应用到其他GPCR与带来的好处

  • 结合相互作用的高度特异性检测由于BRET的固有距离约束
  • 小和最小干扰生物发光肽标签
  • 选择性细胞表面检测
  • 非放射性和齐活细胞测定
  • 高通量 - 可以在HTS格式被用于化合物分析

图结合的荧光标记的普萘洛尔瞬时表达HiBit-β2-AR

HEK-293细胞用HiBit-β2-AR,支架上生长过夜转染,然后用在30μM未修饰普萘洛尔不存在或存在各种浓度的荧光标记的普萘洛尔处理。90分钟温育后,加入HiBit检测试剂和细胞温育之前BRET测量5分钟。数据展现特定的荧光标记普萘洛尔到β2-AR,可以用过量的未修饰的普萘洛尔被竞争结合(n = 3的+/- S.D。)

图:化合物的竞争结合β-AR表示在“新鲜细胞中2-d”,“新鲜细胞在3-d”和冷冻保存的细胞在3-d上的支架。

HEK-293细胞瞬时转染在支架上的支架或TC 2-d然后或者冷冻保存或保持在培养物中3-d处理的96块孔白色板中。当除霜并在培养另外24个小时,所有的组,用荧光标记的普萘洛尔(2nM的EC 80 =)用不同浓度的竞争性化合物的共同治疗。后90分钟的温育期后,将细胞测定BRET前用5分钟HiBit检测试剂一起温育。

DTA表明竞争性通过荧光标记普萘洛尔的位移已知β2-AR的化合物的结合。另外,将细胞在3-d上的支架给予类似于在2-d的反应。此外,从低温保存时回收,上支架的细胞表现出非常相似的IC 50值,使用“2-d新鲜”,“3-d新鲜细胞”获得的那些。

图荧光标记的普萘洛尔与β2-AR。

3-d支架表达HiBit-β2-AR HEK-293细胞用HiBit检测试剂中温育15分钟,然后用各种浓度的荧光标记的普萘洛尔处理。加入紧接着,BRET测定每分钟超过10分钟。数据证明荧光标记普萘洛尔为β2-AR的快速结合速率(n = 3的+/- S.D。)

图荧光示踪剂的位移速率β2-AR通过竞争化合物。3-d支架瞬时转染的HEK-293细胞用HiBit检测试剂温育15分钟,然后用同时处理两个荧光标记的普萘洛尔在2nM的(EC80),在10倍的IC50浓度对于每种化合物的竞争化合物一起。紧接着补充,BRET测定每分钟15分钟。数据通过各化合物的演示了示踪剂的位移速度和表明沙美特罗结合更慢,吲哚洛尔结合更迅速地β2-AR比其它化合物(n = 3的+/- S.D。)

你在找一个CRO来帮助你发现你的下一个突破药吗?

分享这