肿瘤含有低氧（缺氧）的局部区域。细胞适应在这些区域中通过多种补偿机制存活，包括刺激血管生成和代谢切换到葡萄糖作为能量源，因此降低了它们的氧依赖性。我们已经开发了一种生理相关的基于人细胞的测定以筛选小分子，以抑制对缺氧的这种适应性反应的能力。具体地，我们将癌细胞和巨噬细胞暴露于缺氧条件，并测量VEGF分泌作为血管生成途径激活的标志物加乳酸分泌物和葡萄糖摄取以鉴定葡萄糖代谢的变化。还测量细胞数以突出毒性效应的化合物。

专门的缺氧室（Biospherix Inc.）用于将A172胶质母细胞瘤细胞治疗至1％的氧气以模拟肿瘤缺氧核心的水平。在暴露于缺氧之前用10μM化合物预处理细胞。Temsirolimus是一种缺氧驱动的VEGF和乳酸分泌物的强大抑制剂以及葡萄糖摄取作为阳性对照。使用以下市售的测定分别在处理后48小时测量培养物中残留的细胞密度，VEGF和乳酸分泌物Plus葡萄糖;CYPUANT（Thermofisher），VEGF Alphalisa（PerkinElmer），L-乳酸乳酸乳酸盐测定（Cayman）和葡萄糖检测测定（Promega）。

使用Phorbol 12-Myristerate 13-乙酸盐（PMA）将U937单核细胞分化为巨噬细胞表型。分化的巨噬细胞暴露于低氧或高含量乳酸酯的模拟肿瘤微环境条件。对照巨噬细胞与IL-4和IL-13的分化以产生M2表型，已知与肿瘤相关的巨噬细胞共享特征。通过流式细胞术和缺氧处理，如上所述测量的上清液中VEGF水平的分化巨噬细胞。

图1 A和B - A172胶质瘤细胞有力响应缺氧处理，从媒体增加VEGF的分泌和葡萄糖利用，表明自适应表型使肿瘤细胞的存活在低氧区域。Temsirolimus抑制了缺氧驱动的反应。数据=三份培养的平均值+/- S.D。

图2. A，B和C-筛选小分子面板10在A172胶质细胞瘤细胞中μm抑制缺氧驱动反应的能力。测试的Compoounds，149/823（18％）抑制VEGF分泌（图2.a），38/823（5％）抑制VEGF分泌和葡萄糖摄取（图2.C）。

图3-除了增加的葡萄糖摄取外，A172胶质母细胞瘤细胞响应于缺氧，葡萄糖代谢的副产物分泌较高水平的乳酸水平。数据=三份培养的平均值+/- S.D。

图4.A，B-U937单核细胞分化成具有通过增加的粘附，粒度和表面CD11b的上调表达而确定的PMA处理的巨噬细胞表型。巨噬细胞暴露于缺氧或用乳酸刺激的VEGF分泌治疗，表明巨噬细胞通过增强血管生成和增加局部氧气来促进肿瘤进展。